Ocena brak

WZROST DROBNOUSTROJÓW NA PODŁOŻACH - Metody oznaczania liczby drobnoustrojów

Autor /Otomar444 Dodano /20.08.2013

Liczbę bakterii występujących w danym środowisku można określić różnymi metodami. Powszechnie stosowane metody dzielą się na bezpośrednie i pośrednie. Metody bezpośrednie służą do oznaczania sumy żywych i martwych komórek. Metody pośrednie (hodowlane) opierają się na obserwacji wzrostu żywych komórek.

  • Bezpośrednie metody oznaczania liczby drobnoustrojów:

Oznaczanie liczby komórek w polu widzenia mikroskopu. Sposób postępowania:

  • na środku szkiełka podstawowego wyznacza się flamastrem kwadrat o boku 10 mm;

  • na wyznaczoną powierzchnię przenosi się mikropipetą 0,01cm3 badanej zawiesiny bakterii i równomiernie rozprowadzacza po powierzchni;

  • preparat suszy się i utrwala, zabarwia błękitem metylenowym (1-2 min), a następnie spłukuje wodą i suszy;

  • liczbę komórek liczy się w 20 polach widzenia mikroskopu (powiększenie 1000x), po wyliczeniu średniej uzyskane dane podstawia się do wzoru:

Obliczanie wg wzoru: A = N x 4 x 104 / πd2; gdzie:

A – liczba komórek;

N – średnia liczba bakterii w jednym polu widzenia

d – średnica pola widzenia [mm]

Objaśnienie obliczeń:

Średnica pola widzenia mikroskopu d = 0,16 mm

Powierzchnia pola widzenia πr2 = 3,14 (0,08)2 = 0,02 mm2

Powierzchnia rozmazu 10 x 10 = 100 mm2

Jedno pole widzenia reprezentuje 1/5000 część powierzchni rozmazu, która wynosi 0,01 cm3.

Jedna komórka w polu widzenia odpowiada 5.000 komórek w objętości 0,01 cm3 lub 500.000 komórek w objętości 1 cm3.

Oznaczanie liczby komórek przy użyciu komory Thoma.

Komora Thoma jest wykorzystywana do liczenia komórek o wymiarach większych niż 0,4 mm, czyli drożdży, zarodników i fragmentów strzępek grzybów. Komora ma naniesioną siatkę 16 dużych kwadratów (o powierzchni 1/400 mm2 i objętości 1/4000 mm3), z których każdy zawiera 16 małych kwadracików o boku 0,05 mm. Badany materiał nanosi się na komorę, przykrywa szkiełkiem nakrywkowym i liczy pod mikroskopem przy powiększeniu 400x. Dla wiarygodnego wyniku należy policzyć komórki zgodnie z załączonym schematem w 40-80 małych kwadratach. Aby błąd obliczeń nie przekroczył 10% należy zliczyć conajmniej 700 komórek. 

  • Pośrednie metody oznaczania liczby drobnoustrojów:

Posiew ilościowy metodą płytkową (zalewową) Kocha

W metodzie zakłada się, że z każdej pojedynczej komórki bakterii przeniesionej na stałe podłoże wyrasta kolonia. Zatem wynik badania określa liczbę jednostek zdolnych do tworzenia koloni.

Badaną próbkę rozcieńcza się zgodnie z metoda podana w poprzednim rozdziale, następnie wybrane rozcieńczenia posiewa się na płytki Petriego zalewa ostudzonym do temperatury 450C podłożem i po zestaleniu całości inkubuje (temperatura 370C 24-36 godzin). Po okresie inkubacji liczy się wyrosłe kolonie przyjmując, że liczymy te, których liczba mieści się w granicach: 30-200.

Liczbę organizmów oblicza się wg wzoru:

Z = A x stopień rozcieńczenia; gdzie

A = liczba koloni na płytce, Z = liczba organizmów

Wynik podaje się w postaci potęgi dla liczb zawartych między 1,0 a 9,9, pomnożonych przez 10x – gdzie x jest odpowiednią potęgą. Np. w posiewie 1 cm3 z rozcieńczenia 10-3 (1: 1000) stwierdzono, że średnia arytmetyczna wyrosłych koloni (na obu płytkach) wynosi 240, co w przeliczeniu na 1 cm3 badanej próbki wynosi 240 x 1000 = 240 000. Wynik w postaci potęgi wynosi 2,4 x 105.

Posiew powierzchniowy na podłoże stałe

Rozcieńczone próbki badanego materiału posiewa się na zestalony agar w płytkach Petriego w ilościach 0,1 lub 0,5 cm3 i równomiernie rozprowadza po pożywce głaszczką. Po okresie inkubacji liczy się kolonie zgodnie z opisaną wyżej procedurą.

Posiew samoczynny z powietrza - metoda sedymentacyjna

W celu określenia ogólnej liczby bakterii w powietrzu płytki Petriego (Ø 10 cm) z zestalonym agarem należy otworzyć i eksponować 10 min w badanym pomieszczeniu. Po upływie określonego czasu płytki zamknąć i inkubować w temp. 300C przez 48 h.

Po okresie inkubacji liczymy wyrosłe kolonie, a następnie posługując poniższym wzorem obliczamy ilość bakterii i grzybów w 10 dm3 powietrza:

N = a × 100/ b × k; gdzie:

N – liczba drobnoustrojów w 10 dm3 powietrza

a – średnia liczba kolonii z płytek (na jedno badanie 3 płytki )

b – powierzchnia płytki – dla płytki o średnicy 10 cm pow. wynosi 78,5 cm2

k – współczynnik czasu ekspozycji płytki – dla 10 min k = 2

100 – przelicznik powierzchni płytki na 100 cm2

Liczenie koloni na filtrach membranowych

Płynną próbkę filtruje się przez odpowiedni filtr membranowy zatrzymujący bakterie. Filtr z bakteriami umieszcza się na podłożu hodowlanym. Po okresie inkubacji filtr z podłoża przekłada się na 15 min. na bibułę nasączoną 0,01% roztworem błękitu metylenowego. Zabarwiony filtr przepłukuj się wodą destylowaną. Filtr jest jasnoniebieski zabarwione bakterie ciemniejsze. Do policzenia wybiera się filtry zawierające 20 –100 koloni. Wynik badania przelicza się na 100 cm3 lub 1 cm3.

Określanie najbardziej prawdopodobnej liczby drobnoustrojów NPL

Metodę tą stosujemy przy obliczaniu drobnoustrojów, które występują w niewielkiej liczbie w badanym materiale. W metodzie tej posiewy dokonuje się równolegle do ustawionych w 3 rzędach 3 lub 5 probówek (płytek) zawierających 10 cm3 lub 15 cm3 podłoża. Do pierwszego rzędu posiewa się 10 cm3 próbki z rozcieńczenia wyjściowego, a do dwóch następnych rozcieńczeń po 1cm3. Po inkubacji z odpowiednich tabel opartych na rachunku prawdopodobieństwa odczytuje się najbardziej prawdopodobną liczbę bakterii.

Modyfikacje metody Kocha

Do określania liczby drobnoustrojów wykorzystuje się często gotowe zestawy przygotowywane przez liczne firmy farmaceutyczne. Zestaw składa się z pojemnika zawierającego sztywny pasek pokryty obustronnie pożywką agarową. Z reguły jedna strona paska ma podłoże do wzrostu bakterii, a druga podłoże do wzrostu grzybów. Pasek ten jest umocowany w zakrętce naczynia. Posiew można wykonać trzema sposobami: albo zanurzamy pasek w całości w badanej płynnej próbce materiału, albo poprzez metodę odciskową dotykamy z obu stron wybranej powierzchni lub nawilżamy obustronnie materiałem badanym. Po posiewie pasek umieszczamy w pojemniku i inkubujemy w określonej temperaturze. Po okresie inkubacji oceniamy ilość wyrosłych koloni przez porównanie z dołączonym wzorcem.

Podobne prace

Do góry