Ocena brak

Screening banku genów czyli identyfikacja odpowiedniego klonu - METODY HYBRYDYZACYJNE

Autor /Polikarp Dodano /12.10.2011

Stosuje się w przypadku dysponowania sondą molekularną DNową lub RNową homologiczną do poszukiwanej sekwencji w różnym stopniu - niekoniecznie w 100%. Nie jest w tym przypadku wymagana ekspresja sklonowanego genu w komórkach gospodarza.

Hybrydyzacja - powstawanie stabilnych struktur dwuniciowych z cząsteczek o komplementarnych sekwencjach nukleotydów. Pojawiają się one już nawet wtedy gdy istnieją kilkunastonukleotydowe odcinki o komplementarnym układzie zasad. Kompleks taki charakteryzuje się specyficzną "temperaturą przejścia" powyżej której ulega dysocjacji. Specyficzność hybrydyzacji zależy od sekwencji i składu nukleotydów , siły jonowej stosowanych buforów oraz temperatury. Operując tymi parametrami możemy uzyskiwać hybrydyzację cząsteczek , których homologia nie przekracza 50%.

Sondą molekularną może być odcinek DNA lub RNA homologiczny do fragmentu , który chcemy odnaleźć. Niekoniecznie w pełni komplementarny do poszukiwanej sekwencji. Wtedy także zachodzi hybrydyzacja jednak z mniejszą wydajnością a utworzony kompleks jest mniej trwały. Sonda musi być wyznakowana (radioaktywnie lub nieradioaktywnie) czyli związana ze znacznikiem , który umożliwi jej uwidocznienie a zarazem zlokalizowanie zhybrydyzowanej z nią sekwencji.

Sondy :

- Fragment DNA , cDNA lub RNA poszukiwanego przez nas genu sklonowanego wcześniej z innego gatunku dość blisko spokrewnionego. W tym celu wybieramy region ewolucyjnie konserwowany w DNA danego genu czyli taki , w którym w czasie ewolucji nie nagromadziło się zbyt dużo znaczących zmian nawet u różnych , czasami nawet dość odległych ewolucyjnie gatunków. Warunki hybrydyzacji muszą być odpowiednio dobrane. Część poszukiwanego przez nas genu.

- Syntetyczny oligonukleotyd o sekwencji komplementarnej do odcinka DNA kodującego fragment białka jeśli znana jest sekwencja aminokwasowa tego białka. W praktyce oznacza to zsyntetyzowanie całej rodziny takich oligonukleotydów z powodu zdegenerowania kodu genetycznego , z których tylko część będzie idealnie komplementarna do poszukiwanej sekwencji.

- Sonda utworzona dzięki amplifikacji metodą PCR np. bardzo rzadkiego fragmentu DNA.

Sondy znakować można :

- radioaktywnie - do sondy włączany jest nukleotyd znakowany radioaktywnym izotopem. Detekcja opiera się na autoradiografii przy zastosowaniu filmów wrażliwych na promieniowanie.

- nieradioaktwnie np. metodami fluorescencyjnymi - emisja światła o określonej długości fali , wykorzystywane są związki tj. Rodamina , kumaryna czy fluoresceina. Detekcja odbywa się przy pomocy mikroskopu fluorescencyjnego.

- immunochemicznie , cytochemicznie - do sondy włączany jest nukleotyd sprzężony z haptenem (biotyną , digoksygeniną , fluoresceiną). Detekcja odbywa się przy pomocy przeciwciał specyficznych dla danego haptenu. Przeciwciała są sprzężone z umożliwiającymi ich uwidocznienie cząsteczkami : alkaliczną fosfatazą , peroksydazą , barwnikami fluorescencyjnymi czy koloidalnym złotem.

- enzymatycznie - do sondy włączany jest nukleotyd sprzężony z cząsteczką enzymu. Detekcja opiera się na reakcji barwnej katalizowanej przez enzym markerowy.

Metody hybrydyzacyjne to :

- HYBRYDYZACJA TYPU SOUTHERN (DNA-DNA)

- HYBRYDYZACJA TYPU NORTHERN (RNA-DNA)

- HYBRYDYZACJA KOLONIJNA

Hybrydyzacja kolonijna - po transformacji komórek bakteryjnych bankiem plazmidowym. Po wysianiu na szalki Petriego replikuje się kolonie na filtr. Wykonuje się szereg czynności , które mają na celu przytwierdzenie bakterii , ich lizę i denaturację in situ a następnie poddaje się hybrydyzacji i autoradiografii. Dzięki zachowaniu szalki wzorcowej jesteśmy w stanie określić dokładnie kolonię , w której znajduje się hybrydyzujący fragment.

- HYBRYDYZACJA ŁYSINKOWA

Hybrydyzacja łysinkowa - po transformacji komórek bakteryjnych bankiem fagowym i wysianiu ich na szalki Petriego replikuje się kolonie na filtr. Przytwierdza się przeniesione fagi do filtru i hybrydyzuje z sondą i poddaje autoradiografii. Także w tym przypadku dzięki szalce wzorcowej jesteśmy w stanie zidentyfikować łysinki , których pozycje odpowiadają zaczernieniom na kliszy.

Podobne prace

Do góry