Ocena brak

Rekombinacja DNA w medycynie i farmacji

Autor /Polikarp Dodano /12.10.2011

Pierwszym udanym eksperymentem tego typu było wyprodukowanie ludzkiego białka - somatostatyny - 14 aminokwasowego neurotransmitera peptydowego. Gen kodujący somatostatynę został zsyntetyzowany chemicznie i sklonowany w wektorze plazmidowym eksprymowanym w E.coli. Pierwszym komercyjnym produktem była ludzka insulina.

Obecnie dzięki technologii rekombinowanego DNA uzyskiwane są białka wykorzystywane w leczeniu szeregu chorób : raka , alergii , chorób autoimmunologicznych , neurologicznych , atakach serca , chorobach krwi , infekcjach , chorobach genetycznych.

Całkiem nowe podejście do produkcji leków wyrosło właśnie z technologii rekombinacji DNA , gdy uczeni uzyskali możliwość tworzenia subtelnych zmian w naturalnych białkach usprawniających ich funkcjonowanie i zwiększających użyteczność.

Techniki i metody stosowane w inżynierii genetycznej wykorzystuje się przy produkcji :

- szeregu enzymów

- biologicznie czynnych białek (interferony , czynniki krzepnięcia)

- antybiotyków (penicylina , streptomycyna)

- hormonów (insulina , somatotropina , somatostatyna).

Ponadto znalazły one zastosowanie przy :

- mapowaniu chromosomów

- wykrywaniu mutacji punktowych np. beta-talasemii , fenyloketonurii , dystrofii mięśniowej

Duchenne`a)

- wykrywaniu submikroskopowych delecji , insercji czy translokacji

- badaniu RFLP m.in. w przypadku koagulopatii , mukowiscydozy itd.

RFLP - polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych. Indywidualne genomy ludzkie różnią się między sobą - występuje polimorfizm genetyczny. Odcinki DNA uzyskane po trawieniu restrykatazami są charakterystyczne dla każdego genomu. Udało się w przypadku niektórych chorób o podłożu genetycznym skorelować mutację powodującą stratę bądź uzyskanie miejsca restrykcyjnego z występowaniem choroby.

INŻYNIERIA GENETYCZNA W MEDYCYNIE I FARMACJI

PROFILAKTYKA

- Choroby infekcyjne - nowa generacja szczepionek :

1. Szczepionki zawierające żywe atenuowane drobnoustroje (atenuacja przez wprowadzenie do genomu ściśle określonych mutacji delecyjnych).

Przykłady :

- szczepionki przeciwko Salmonella typhi.

2. Szczepionki podjednostkowe :

- białka rekombinacyjne - wektory pochodzenia wirusowego zrekombinowane z genami kodującymi immunogenne białka organizmu patogennego

- białka syntetyczne.

Przykłady :

- nowa szczepionka antykrztuścowa

- fragment genu Clostridium tetani kodujący domenę toksyny odpowiedzialną za jej immunogenność sklonowano w komórkach E.coli

- szczepionka przeciwko wirusowi żółtaczki Hepatitis B produkowana w komórkach drożdży dzięki ekspresji antygenu otoczki wirusowej : gen białka otoczki został wstawiony w wysokokopijny wektor drożdżowy , wirusowe białko było produkowane w dużej ilości.

3. Profilaktyka genowa tzw. III generacja szczepionek :

- podanie czystego genu - "nagie" szczepionki.

Przykłady :

- wstrzyknięcie do mięśni szkieletowych DNA wirusa grypy w formie plazmidu indukuje powstanie specyficznych cytotoksycznych limfocytów T.

Szczepionki otrzymane metodami rekombinacji DNA są stabilne a ich stosowaniu nie towarzyszą niepożądane objawy , proces wytwarzania jest bezpieczny. Preparaty można stosunkowo szybko modyfikować i dostosowywać do zmian cech patogennego organizmu.

- Choroby genetyczne spowodowane defektem w pojedynczym genie bądź wielogenowe.

Strategia większości szczepionek nowotworowych polega na dostarczeniu antygenów nowotworowych wraz z odpowiednim sygnałem kostymulującym co ma na celu swoistą aktywację układu odpornościowego przeciwko komórkom przerzutowym nowotworu. Powstała koncepcja nowej generacji szczepionek nowotworowych genetycznie modyfikowanych. Strategia polega na pobraniu i izolacji komórek nowotworowych od chorego , wprowadzeniu genu czynnika immunomodulującego (cytokiny , antygeny nowotworowe itp.) , namnożeniu in vitro i podaniu podskórnym choremu lub bezpośrednio do guza. Jako nośnika genów używane są rekombinowane wirusy , głównie retrowirusy i adenowirusy. Podejmowane są próby w profilaktyce głównie czerniaka złośliwego , raka nerki , białaczki , raka płuc i piersi.

DIAGNOSTYKA

- Choroby infekcyjne :

- sondy genetyczne - diagnozowanie bez konieczności namnażania mikroorganizmów

- PCR - wykrywanie minimalnej ilości mikroorganizmów.

- Choroby genetyczne :

Lista chorób , które można obecnie rozpoznawać wykorzystując techniki analizy DNA obejmuje już w tej chwili dobrze ponad sto jednostek chorobowych , m.in. są to : achondroplazja, hemofilia , fenyloketonuria , anemia sierpowata , talasemie , mukowiscydoza i in.

- diagnostyka prenatalna m.in. RFLP

- choroby nowotworowe.

TERAPIA

- Nowa generacja leków.

Przykłady :

1. Insulina - pierwszy lek uzyskany technikami inżynierii genetycznej , który uzyskał licencję.

Insulina używana wcześniej w leczeniu cukrzycy , uzyskiwana z trzustek świni i krów , nie była identyczna z ludzką. Dlatego też niektórzy pacjenci wytwarzali przeciwciała przeciwko temu białku. Insulina stworzona dzięki inżynierii genetycznej jest identyczna z ludzką. Eksprymowana jest w komórkach E.coli. Poprzednio łańcuchy A i B były produkowane oddzielnie a następnie fałdowane w dojrzałą cząsteczkę insuliny. Obecnie w celu produkcji komercyjnej , eksprymowane jest pojedyncze fuzyjne białko , które następnie jest przecinane i w taki sposób uzyskuje się w jednym kroku dojrzałą , zrekombinowaną insulinę.

2. Ludzki hormon wzrostu (hGH) - produkowany w komórkach bakteryjnych na dwa sposoby. Skonstruowano wektor ekspresyjny używając cDNA kodującego większość aminokwasów i dodano syntetyczny oligonukleotyd początkowy. Hormon był eksprymowany wewnątrzkomórkowo. Drugim sposobem było dodanie na początku genu sekwencji sygnałowej , która umożliwiła transport białka do przestrzeni peryplazmatycznej skąd łatwo można było uwolić hormon za pomocą dysrupcji hypotonicznej zewnętrznej błony.

3. Tkankowy aktywator plazminogenu (tPA) jest produkowany komercyjnie w ssaczych kulturach komórkowych. Sklonowano ludzkie cDNA tego genu , wstawiono pod silny promotor i terminator. Wektorem została stabilnie stransfekowana linia komórek ssaczych. Linie wysoko eksprymujące to białko hodowane są w dużych fermentatorach a zrekombinowany tPA jest oczyszczany z pożywki.

4. Czynnik VIII , niezbędny do prawidłowego krzepnięcia krwi , jest także produkowany przez ssacze komórki. Od wielu lat hemofilitykom podawano ten czynnik oczyszczany z ludzkiej krwi. Przyczyniło się to w pewien sposób do rozszerzenia pandemii AIDS. Obecnie cDNA genu tego białka zostało sklonowane. Podobnie jak tPA , czynnik VIII jest dużym kompleksem białkowym , który prawidłowo może być składany i produkowany tylko w komórkach ssaczych.

- Somatyczna terapia genowa - genetyczne modyfikacje komórek somatycznych.

Terapia genowa poprzedzona musi być sklonowaniem odpowiedniego genu , identyfikacją jego sekwencji regulacyjnych i komórek , w których działa oraz wyborem wydajnych metod ich transfekcji. Powinno się także przeprowadzić badania , które bezsprzecznie dowiodą , że wprowadzony prawidłowy gen działa zgodnie z przewidywaniami a także nie narusza metabolizmu zrówno komórki , do której go wprowadzono jak i całego organizmu. Możliwe są dwa warianty terapii : albo wprowadza się kilka dodatkowych kopii prawidłowego genu albo wymienia gen defektywny na prawidłowy. Metody wprowadzenia genu także są dwie : albo pobiera się docelowe komórki z organizmu pacjenta , modyfikuje genetycznie in vitro , po czym powtórnie wprowadza do organizmu albo wprowadza się gen bezpośrednio do całego organizmu lub tkanki.

Trudności :

- kłopoty ze znalezieniem wydajnego systemu transfekcji komórek eukariotycznych

- charakter ekspresji wprowadzonych genów niestety najczęściej jest przejściowy.

Podejmuje się próby leczenia :

- chorób spowodowanych defektem w pojedynczym genie

- chorób wielogenowych (układu krążenia , nerwowego , nowotwory)

- autoagresywnych chorób układu odpornościowego.

Przykłady :

- Próba wyznakowania genetycznego limfocytów odseparowanych z litego guza chorego. Wprowadzono do limfocytów marker (gen oporności na neomycynę) co pozwoliło na śledzenie ich losów po powtórnym wstrzyknięciu , następnie po ponownym pobraniu transfekowano je in vitro genami kodującymi czynnik martwicy nowotworów i interleukinę 2.

- Próba leczenia SCID (ciężki złożony niedobór immunologiczny). Do krwioobiegu wprowadzono limfocyty transfekowane wektorem retrowirusowym z prawidłowym genem. Rezultatem była odporność na antygeny i pojawienie się przeciwciał.

- Próba leczenia hemofilii B. Wprowadzono gen czynnika IX do hemocytoblastów za pośrednictwem wektorów retrowirusowych.

- Próba leczenia rodzinnej hipercholesterolemii. Przy udziale wektora adenowirusowego wprowadzono gen kontrolujący syntezę receptora LDL do hepatocytów.

- Próbowano także wyleczyć niedobór somatotropiny przy udziale wektora retrowirusowego przenosząc geny do hepatocytów.

Terapia genowa nie została do tej pory wprowadzona do praktyki klinicznej.

Bardzo istotnymi dla rozwoju wielu z powyższych zastosowań okazały się m.in. technologie :

- Produkcja przeciwciał monoklonalnych. Izoluje się komórki śledziony myszy immunizowanej antygenem , miesza się je ze zmutowanymi (niezdolnymi do wzrostu na pewnej pożywce) komórkami lini szpiczaka (myeloma). Niektóre z nich ulegną fuzji. Selekcjonuje się je in vitro na podłożu , na którym rosną tylko klony hybrydowe i hoduje w studzienkach zawierających potomstwo jednej komórki. Taki klon hybrydowy będzie produkował przeciwciała o pożądanej specyficzności wobec różnych determinant antygenu użytego do immunizacji i będzie nieśmiertelny. Monoklonalne przeciwciała są w tej chwili szeroko używane w diagnostyce infekcji i raka oraz do szeregu innych celów.

- W technologii zwanej inżynierią białek używa się rekombinowanego DNA w celu zmodyfikowania struktury naturalnego białka aby ulepszyć lub zmienić jego funkcje. Dobrym przykładem są tutaj przeciwciała ponieważ ich potencjalne zastosowanie w medycynie jest bardzo duże a ich struktura jest w dość znacznym stopniu poznana. Możliwe są zmiany ich domen efektorowych - regionów łańcucha ciężkiego , które wyznaczają specyficzność funkcjonowania przeciwciała. Obiecującą strategią jest zastąpienie domeny efektorowej sekwencją kodującą toksynę. Takie fuzyjne przeciwciało dostarczy toksynę specyficznie do komórek , które posiadają docelowy antygen. Może mieć to duże znaczenie w leczeniu raka lub takich wirusowych chorób jak np. AIDS.

Różnorodność nowych technologii skłania do zastanowienia się nad praktycznie nieograniczonymi możliwościami ich ingerencji , w pozytywnym tego słowa znaczeniu , w życie współczesnego człowieka.

Podobne prace

Do góry