Ocena brak

Cytologia mleka mastitowego

Autor /kokoszka Dodano /28.05.2014

Choroby wymienia (mastitis) objawiające się m.in. wzrostem liczebności komórek somatycznych w mleku zmusiły do określenia górnych granic ich liczby dla mleka nonnalnego, a więc określenia tzw. wartości krytycznej. Takie działanie miało również na celu usprawnienie diagnostycznej oceny przydatności m leka do przetwórstwa i sygnalizowanie początku chorobowych zmian zachodzących w gruczole mlekowym. Pierwotnie granicę tę ustalono na 500 tys. elementów komórkowych w l cm'1 mleka. Obecnie jednak, szczególnie w krajach Unii Europejskiej, granicę tę proponuje się obniżyć do 300 tys. w 1 cmJ mleka, a niektóre kraje obniżają tę granicę nawet do 250 tys. Dążąc więc do wejścia na konkurencyjny iynek tych państw, krajowi producenci muszą już dzisiaj dostosowywać się do tych ostrych wymogów. Ważny więc staje się szybki i właściwy dobór metod oceny jakości cytologicznej mleka oraz ocena wskazań tych metod do określenia przydatności surowca do przetwórstwa.

Najdokładniejsza i w dalszym ciągu odwoławcza jest metoda bezpośredniego liczenia komórek somatycznych mleka pod mikroskopem, opracowana w 1910 roku przez Prescotta i Breeda. Oznaczenie polega na barwieniu 0,5-procentowym roztworem błękitu metylenowego specjalnie przygotowanych rozmazów mleka, a liczenie odbywa się pod mikroskopem w co najmniej 10 polach widzenia. Mimo dużej dokładności metoda ta jest jednak wykorzystywana do rutynowych badań tylko w niewielu krajach (Izrael, Japonia, USA), co wynika przede wszystkim z faktu dużej jej pracochłonności, W przypadku dużego rozdrobnienia bazy surowcowej, jak np. w Polsce, oznaczenie jakości cytologicznej mleka tą metodą jest już praktycznie niewykonalne. Pewien postęp w tym kierunku dała metoda wykorzystująca do barwienia oranż akrydynowy, który w połączeniu z DNA lub RNA leukocytów daje fluoryzujące kompleksy. Pomiar w tej metodzie polega na liczeniu fluoryzujących punktów pod mikroskopem z wykorzystaniem światła ultrafioletowego. Atutem tej metodyjest także, podobnie jak w klasycznej metodzie Prescotta i Breeda, możliwość rozróżnienia rodzaju komórek występujących w obrazie cytologicznym mleka.

Natomiast coraz rzadziej wykorzystywane są w ocenie cytologicznej mleka metody pośrednie. Stosuje się je przeważnie do orientacyjnej oceny surowca. Jedną z najstarszych metod jest tzw. test Whiteside’a opracowany w 1933 roku. W metodzie tej miesza się 5 kropli mleka z 2 kroplami 0,1 N roztworu NaOH i obserwuje obraz reakcji odczynnika testowego z DNA leukocytów. Wynik oznacza się na podstawie stopnia zmian wyglądu zewnętrznego próbki. Dla każdego wyglądu próbki badanego mleka przyporządkowany jest tutaj wynik i przedział liczebności komórek somatycznych. Próba ta daje jednak bezsporne wyniki dopiero przy liczbie komórek ponad 1 min w 1 cm3 mleka. Natomiast w zakresie od 500 tys. do 1 min komórek w 1 cm3 mleka wyniki są mało miarodajne. Jeszcze mniej wiarygodne wyniki uzy-skuje się w zakresie poniżej 500 tys. komórek somatycznych w 1 cm mleka. Ponadto granice przedziałów liczby elementów komórkowych są tak płynne dla poszczególnych odczynów, że trudno jest precyzyjnie określić normalność mleka. Tak więc przy ogólnej tendencji zaostrzania wymagań w zakresie jakości cytologicznej mleka surowego test ten może w najbliższym czasie okazać się nieprzydatny.

Innym znanym powszechnie testem pośrednim jest test kalifornijski - test Schal-ma (CMT - Califomia Mastitis Test) i odpowiadający mu w warunkach krajowych TOK (Terenowy Odczyn Komórkowy). Mechanizm oznaczania sprowadza się tutaj do reakcji pomiędzy kwasami nukleinowymi komórek somatycznych zawartych w mleku a roztworem NaOH, który jest jednocześnie wskaźnikiem odczynu mleka. Substancja powierzchniowo czynna rozpuszcza błonę komórkową, ułatwiając kontakt ługu sodowego z DNA leukocytów. Wynik uzyskuje się na podstawie analizy wzrokowej odczynu mleka oraz obrazu mieszaniny mleka i odczynnika testowego. Górna granica ujemnego odczynu obu testów wynosi 200 tys. komórek somatycznych w 1 cm mleka. Test ten jest jednak mało skorelowany z rzeczywistą liczbą elementów komórkowych w mleku i może wykazywać reakcję ujemną nawet wtedy, gdy liczba elementów komórkowych w mleku przekracza 300 tys. w 1 cm3. Metoda ta daje jednak pewne wyniki przy liczbie komórek ponad 500 tys. w 1 cm3 mleka. Zdarzają się też przypadki, gdy określony odczyn występuje wcześniej, niżby na to wskazywała rzeczywista liczba komórek somatycznych. Współczynnik korelacji dla tej metody i za pomocą liczenia komórek somatycznych aparatem Fossomatic 90 wynosił 0,22 - w przypadku mleka z wczesnej laktacji, a 0,27 - w przypadku mleka z późnego okresu laktacji.

Kolejną z metod pośrednich jest test brabancki (Brabantic Mastitis Reaction BMR). Zasada odczynu jest tutaj podobna jak w przypadku CMT, z tą różnicą, że odczynnik testowy miesza się z mlekiem, dozuje na lejki z kapilarami, a następnie w pewnych odstępach czasu (5, 10, 20, 60 sekund) fotografuje się lustro mieszaniny w lejku. Korzystając z krzywej wzorcowej, określa się (na podstawie średnicy lustra cieczy w lejku) liczebność komórek somatycznych. Jest to więc pomiar czasu wypływu mieszaniny mleka i odczynnika testowego z lejka. Wydaje się, że stosowanie BMR do oceny mleka zbiorczego nie jest jednak wskazane ze względu na jego małą dokładność i precyzję w zakresie 500-1000 tys. elementów komórkowych w 1 cm3 mleka. Test BMR jest również mało skorelowany z metodami bezpośredniego liczenia elementów komórkowych.

Wisconsin Mastitis Test (WMT) polega na pomiarze ilości pozostałej w probówkach mieszaniny mleka z odczynnikiem testowym (taki sam jak przy CMT). W tej metodzie wykorzystuje się zjawisko wzrostu lepkości mieszaniny przy wzrastającej liczebności elementów komórkowych w mleku, co wydłuża jej czas wypływu z probówki. Jest on w miarę dobrze skorelowany z metodami bezpośredniego liczenia dopiero przy liczebności komórek somatycznych powyżej 500 tys. w 1 cm3.

W polskich warunkach stosowany jest wiskozymetr probówkowy lub inaczej obrotowy. Zasada analizy jest podobna jak w przypadku WMT. Odczynnikiem testowym jest Mastirapid. Wynik odczytuje się z krzywej wzorcowej lub wylicza z zależności:

y = (0,7824x - 5,4943)105

dla: 9 < x < 48 mm gdzie:

x - wysokość słupa mieszaniny mleka i odczynnika testowego w probówce

wiskozymetru [mm], y - liczba komórek somatycznych w 1 cm3 mleka.

Kolejną ze znanych metod pośrednich jest metoda nowozelandzka wykorzystująca wiskozymetr kulkowy Ruakura (Ruakura Rolling Bali Viscometr - RRBV). Zasada oznaczania polega na pomiarze zmian lepkości mieszaniny mleka i odczynnika testowego (identyczny jak przy CMT). Mierzy się tutaj czas toczenia stalowej kulki w pochyłej rurce wypełnionej tą mieszaniną. Czułość metody jest duża i w zakresie od 150 tys. do 1 min komórek w 1 cm3 mleka jest dobrze skorelowana z metodą bezpośredniego liczenia pod mikroskopem i z wynikami uzyskanymi za pomocą licznika Coultera.

W pomiarze liczebności elementów komórkowych pomocne mogą być też testy wykorzystujące reakcje DNA komórek somatycznych z różnymi odczynnikami barwiącymi. Mierzy się w nich absorpcję światła przez utworzone w czasie reakcji kompleksy. Należy do nich m.in. metoda Dremela i innych, w której mleko mieszane jest z tritonemjc - 100, a następnie mieszanina przepuszczana jest przez filtr o porach wielkości 3-5 Jim. Po przepłukaniu błon filtrujących, elementy komórkowe zadawane są 5 N roztworem HC1 i 0,06% roztworem indolu, a po 25 minutach ogrzewania w temperaturze 90°C mierzy się absorpcję światła przy długości fali / = 490 nm. Wielkość ta jest odnoszona do krzywej zależności absorpcji światła od liczby komórek somatycznych. Absorpcja równa0,093 odpowiada 1 min komórek somatycznych. Metoda ta zawyża jednak liczbę elementów komórkowych średnio o 27% w stosunku do wyników otrzymanych metodą bezpośredniego liczenia pod mikroskopem oraz prawie o 34% w' porównaniu z wynikami otrzymanymi metodą fluorescencyjną (Fossomatic 90).

Dokładniejsze i najchętniej obecnie stosowane w ocenie cytologicznej jakości mleka są metody wykorzystujące technikę cyfrową. Na uwagę zasługuje tutaj między innymi licznik Coultera. Idea oznaczania liczby komórek oparta jest w tej metodzie na „prawie Coultera” stwierdzającym, że cząstki lub komórki przechodzące przez szczelinę między elektrodami w środowisku elektrolitu powodują zmianę oporu na drodze prądu. Wielkość tej zmianyjest proporcjonalna do wymiarów objętościowych cząstek lub komórek, natomiast liczba zmian w jednostce czasu jest proporcjonalna do liczby cząstek lub komórek w zawiesinie. W celu wyeliminowania wpływu obecności kuleczek tłuszczowych, traktuje się je roztworami zwiększającymi ich dyspersję (Somafix). Współczynnik korelacji między wynikami otrzymywanymi za pomocą licznika Coultera a metodą bezpośredniego liczenia pod mikroskopem jest bliski 0,9. Dodatkową zaletą tego urządzenia jest szybkość pomiarów, natomiast wadą jest konieczność częstej i kłopotliwej kalibracji i standaryzacji aparatu.

Najczęściej chyba stosowanym urządzeniem do wykonywania pomiarów liczebności elementów komórkowych w mleku jest aparat Fossomatic. Wykorzystuje on zjawisko fluorescencji kompleksów DNA elementów komórkowych z etylobrom-kiem. Kompleksy te wywołujące impulsy świetlne zliczane są przez fotopowielacz i podawane w postaci odczytu cyfrowego. Współczynnik korelacji wyników otrzymanych za pomocą aparatu Fossomatic 90 z wynikami otrzymanymi metodą bezpośredniego liczenia pod mikroskopem wynosi 0,92-0,99. Zaletą urządzenia jest łatwość wykonania pomiarów oraz ich szybkość. W zależności od typu, a co za tym idzie unowocześnienia aparatu, może on wykonać nawet do 360 analiz na godzinę.

Stosuje się także urządzenia wykorzystujące do oznaczania liczby elementów komórkowych w mleku pomiar rozproszenia światła, np. Somascop. Próbkę mleka trzeba najpierw potraktować odczynnikiem, który znosi zakłócenia spowodowane obecnością innych większych cząstek (np. tłuszczu). Cząstki te są rozpuszczane, a następnie mieszaninę przepuszcza się w postaci cienkiego filmu pomiędzy dwiema szklanymi ściankami, przez które przechodzi wiązka światła. Komórki somatyczne obecne w mleku powodują rozproszenie tej wiązki, a wielkość stopnia rozproszenia zależna jest od liczebności komórek. Impulsy rozproszonego światła są zamieniane na impulsy elektryczne przez fotomnożnik. Liczba tych impulsów odpowiada liczbie komórek somatycznych.

Ograniczenie przez zakłady mleczarskie odbioru mleka pochodzącego od krów z zapaleniem wymienia zależy od doboru odpowiedniej metody oceny jakości cytologicznej mleka. Najlepiej jest ją określać na podstawie bezpośredniego oznaczania liczebności w nim elementów komórkowych bądź bardzo dokładnych, ale drogich urządzeń typu Fossomatic czy też licznik Coultera. Dla naszego kraju pozostaje korzystanie z pośrednich metod analizy cytologicznej mleka.

 

Podobne prace

Do góry